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山东大学学报(医学版)

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人miRNA let7a2质粒的构建及其表达

关恒云1，张菊1，张鹏举1，陈蔚文1，刘闻闻2，于春晓3，胡晓燕1，姜安丽1
  

  1. (山东大学 1. 医学院生物化学与分子生物学研究所， 济南 250012；2. 附属省立医院耳鼻喉头颈外科， 济南 250021； 3. 附属省立医院内分泌科， 济南 250021）
  • 收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2009-02-16 发布日期:2009-02-16
  • 通讯作者: 姜安丽

Construction and expression of eukaryotic expression
plasmid of microRNA let7a2 in lung cancer cells

GUAN Hengyun1, ZHANG Ju1, ZHANG Pengju1, CHEN Weiwen1,　 LIU Wenwen2, YU Chunxiao3, HU Xiaoyan1, JIANG Anli1
   

  1. (1. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;2. Department of OtolaryngologyHead and Neck Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;3. Department of Endocrinology, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)
  • Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2009-02-16 Published:2009-02-16
  • Contact: JIANG Anli

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摘要： 目的构建人miRNA let7a2真核表达质粒，检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板，将RTPCR扩增let7a2的前体（prelet7a2）序列, 克隆至pSilencer4.1CMV neo表达载体中，构建pSilencer4.1let7a2重组质粒，转染A549细胞,采用RTPCR法检测prelet7a2的表达；构建let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T，与pSilencer4.1let7a2质粒共转染A549细胞，测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用；采用MTT比色法检测pSilencer4.1let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果构建的人let7a2真核表达质粒pSilencer4.1let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T经酶切及测序鉴定正确；pSilencer4.1let7a2质粒转染A549细胞后，RTPCR检测prelet7a2表达较对照组明显增强；MTT比色法显示let7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1let7a2 质粒和pMIRReportlet7a2T质粒共转染A549细胞后，通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低，显示let7a2表达质粒转染A549细胞后，可有效表达let7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let7a2。 结论成功构建了人let7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。

关键词: 肺肿瘤, 基因表达调控, miRNA, let7a2

Abstract:

To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid of microRNA let7a2 and express it in lung cancer A549 cells. Methodslet7a2 precursor sequence was amplified by RTPCR using RNA from A549 cells and was cloned into the pSilencer4.1 CMV neoexpression vector to produce the recombinant pSilencer4.1let7a2. Then the recombinant pSilencer4.1let7a2 was transfected into lung cancer A549 cells, and the prelet7a2 expression was verified by RTPCR. According to the miRBase Targets database, the target sequence of let7a2 was synthesized and inserted to the pMIRReport luciferase reporter vector to construct pMIRReportlet7a2T, which was cotransfected with pSilencer4.1let7a2 into A549 cells, and the relative luciferase activity was detected. The effect of let7a2 on A549 cell proliferation was tested by MTT. ResultsThe results of DNA sequencing showed that sequences of pMIRReportlet7a2T and pSilencer5.1let7a2 were correct. RTPCR prelet7a2 was overexpressed in A549 cells after transfection of pSilencer4.1let7a2. Cotransfection of pSilencer4.1let7a2 and pMIRReportlet7a2T showed that mature let7a2 had biological activity. MTT results indicated that let7a2 inhibited proliferation of the transfected A549 cells. ConclusionThe eukaryotic expression plasmid of let7a2 was successfully constructed and effectively expressed in A549 cells.

Key words: Lung neoplasms, Gene expression regulation, miRNA, Let7a2

中图分类号: 

  • Q78
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