人BNIP3真核表达载体和shRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响

山东大学学报(医学版) ›› 2012, Vol. 50 ›› Issue (6): 70-.

人BNIP3真核表达载体和shRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响

孙磊，魏清，张颖，韩丽辉

山东大学医学院免疫学研究所, 济南 250012

收稿日期:2012-01-06 出版日期:2012-06-10 发布日期:2012-06-10
通讯作者: 韩丽辉(1974- )，女，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫学相关研究。 E-mail：hanlihui@sdu.edu.cn
作者简介:孙磊(1980- )，男，硕士研究生，主要从事肿瘤免疫学相关研究
基金资助:
国家自然科学基金(81172352/H1617)

Effects of BNIP3 on autophagy of hepatoma cells: a study using
BNIP3 over-expression vectors and BNIP3-shRNA vectors

SUN Lei， WEI Qing， ZHANG Ying， HAN Li-hui

Department of Immunology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China

Received:2012-01-06 Online:2012-06-10 Published:2012-06-10

摘要/Abstract

摘要：

目的利用人BNIP3的真核表达载体和靶向BNIP3的shRNA表达载体，研究BNIP3过表达和封闭时对肝癌细胞自噬的影响。方法从人肝癌细胞系中，通过RT-PCR扩增人BNIP3基因编码区序列，酶切后插入pcDNA3.1-His-C载体，以此构建重组pcDNA3.1BNIP3真核表达载体。同时构建靶向人BNIP3基因的shRNA表达载体pSilencer-BNIP3。分别经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法对重组载体是否构建成功进行验证。并通过采用Western blot检测自噬标志物LC3蛋白的剪切，研究BNIP3过表达和抑制时对肝癌细胞自噬的影响。结果 pcDNA3.1-BNIP3和pSilencer-BNIP3分别过表达BNIP3和抑制BNIP3的表达。BNIP3过表达能够显著增加肝癌细胞的自噬；BNIP3表达受到抑制时，肝癌细胞的自噬明显减少。结论成功构建了人BNIP3的真核表达载体pcDNA3.1-BNIP3和shRNA表达载体pSilencerBNIP3，并在人肝癌细胞系中证实BNIP3对肝癌细胞自噬的促进作用。

关键词: BNIP3；表达载体；shRNA；自噬；癌，肝细胞

Abstract:

Objective To explore the effects of BNIP3 on autophagy of hepatoma cells by using over-expression vectors and shRNA vectors. Methods BNIP3 cDNA was extracted from human hepatoma cell line BEL-7402 and was cloned into the pcDNA3.1-His-C vector to construct an over-expression vector(pcDNA3.1-BNIP3). The recombinant shRNA expression vector targeting the BNIP3 gene was also constructed(pSliencer-BNIP3). Both recombinant plasmids were verified by sequencing, enzymatic digestion, RT-PCR and Western blot. The effects of BNIP3 on autophagy of hepatoma cells were investigated by transfecting BEL-7402 hepatoma cells with the recombinant plasimids. Results Autophagy of hepatoma cells was significantly enhanced with pcDNA3.1-BNIP3 and compromised with pSilencer-BNIP3. Conclusion BNIP3 was involved in promoting autophagy of hepatoma cells.

Key words: BNIP3； Plasmid； shRNA； Autophagy; Carcinoma, hepatocellular

中图分类号:

R392.11

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