NT4TAT6×HisVHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建

山东大学学报(医学版) ›› 2009, Vol. 47 ›› Issue (7): 32-36.

NT4TAT6×HisVHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建

陈杰 ¹，刘庆勇²，阮喜云³，张士宝¹，张建军²，李宗武²，杨广笑⁴，王全颖⁴

1．山东大学临床医学院，济南 250012； 2．山东大学附属济南市中心医院泌尿外科，济南 250013；
3．山东大学附属济南市中心医院神经内科，济南 250013； 4．西安华广生物工程公司，西安 710025

收稿日期:2009-03-06 发布日期:2009-07-16
通讯作者: 刘庆勇（1962- ），男，副教授，主任医师，主要从事泌尿系肿瘤及肾脏移植研究。 Email：lqylbc@163.com
作者简介:陈杰（1981- ），男，硕士研究生，主要从事泌尿系肿瘤方面研究。Email：drcj@yahoo.cn
基金资助:
山东省自然科学基金资助课题（Y2006C04）。

Construction and identification of recombinant plasmid expressing NT4TAT6×HisVHLβ fusion peptide

CHEN Jie ¹,　LIU Qingyong ²,　RUAN Xiyun ³,　ZHANG Shibao 1,　ZHANG Jianjun ²，　 LI Zongwu ²,　YANG Guangxiao ⁴,　WANG Quanying ⁴

1. School of Clinical Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;
2. Department of Urology, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China;
3. Department of Neurology, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China;
4. Xi′an Huaguang Biological Engineering Co.Ltd, Xi′an 710025, China

Received:2009-03-06 Published:2009-07-16

摘要/Abstract

摘要：

目的构建VHL蛋白(von HippelLindau protein, pVHL)β结构域肾癌抑制融合肽cDNA，并将其应用于肾癌的微基因治疗。方法分别设计合成pVHLβ结构域104123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT6×His cDNA的正、反向引物，使用互为引物模板PCR方法，扩增获得具有NaeI/Eco72I酶识别位点的TAT6×His cDNA片段和具有Eco72I/BamH I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段，将两个片段分别克隆到pGEMT easy中，使用双脱氧终止法测序，通过DNASIS软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列。用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT6×HisVHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中，构建了pBV220NT4TAT6×HisVHLβ质粒。结果经DNA测序证实,获得了编码TAT6×His cDNA片段和编码VHLβ抑制肽的cDNA片段，分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pBV220NT4TAT6×HisVHLβ酶切图谱证实已将NT4TAT6×HisVHLβ融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中。结论成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段，构建了具有NT4信号肽的TAT6×HisVHLβ融合肽cDNA。

关键词: VHLβ结构域肾癌抑制肽；融合肽；微基因；肾肿瘤

Abstract:

The specific amino acid sequence(104123) in βdomain of pVHL is sufficient to inhibit the growth and invasion of renal cell carcinoma（RCC）. To express this peptide for a gene therapy of RCC by using minigene, we constructed and identified the recombinant plasmid expression box, including NT4 signal peptide, tag and cell penetrating peptides. MethodsBy means of asymmetrical primer/template, fragments encoding βdomain of pVHL(the VHL gene product) and TAT6×His were gained, which included Nae I/Eco72I and Eco72I/BamH I restriction enzyme sites. Then the fragments were cloned into vector pGEMT easy. The positive clone was identified by restriction enzymes, and then the cloned amplified fragments were sequenced by a dideoxymediated chaintermination method. The cloned TAT6×HisVHLβ cDNA was compared with the GeneBank sequence by DNASIS. After being digested by Nae I and BamH I, the TAT6×HisVHLβ cDNA fragment was cloned into recombinant vector pBV220NT4, which was also digested by Nae I and BamH I. The constructed recombinant plasmid pBV220NT4TAT6×HisVHLβ was obtained. ResultsThe sequences of TAT6×His and VHLβ cDNA artificially synthesized and analyzed by digestion were consistent with the published results. After analyzing ORF of the cloned TAT6×HisVHLβ cDNA by DNASIS, we found that amino acids encoded by the cloned TAT6×HisVHLβ cDNA were also identical to the published results. ConclusionThe recombinant plasmid expressing TAT cell penetrating peptides and βdomain of pVHL was constructed. Then prokaryotic expressive vector pBV220NT4TAT6×HisVHLβ was constructed by a routine molecular biological method. These results lay a foundation for further research of fusion gene to treat RCC.

Key words: VHLβdomain RCC supressor peptide； Fusion peptide； Minigene； Kidney neoplasms

中图分类号:

R737.11

. NT4TAT6×HisVHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建[J]. 山东大学学报(医学版), 2009, 47(7): 32-36.

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